数字PCR技术在细胞及基因治疗领域的应用概述
数字PCR(dPCR)被称为第三代PCR技术,作为一种新兴技术与旧的PCR技术(例如实时定量PCR)相比,可针对核酸分子做更精确的定量分析(Pinheiro LB, et al.2012;84:1003–11)。数字PCR的创新之处在于标准PCR反应体系经过微滴发生,将目标分子稀释到多个微滴中,每个微滴大体上只包含一个或不包含目标DNA模板,实现”单分子模板PCR扩增”,扩增结束后含有目标分子模板的微滴会给出荧光信号,最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例,分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数。因此,无需标准曲线即可对目标分子进行绝对定量。
基于微滴的数字PCR原理
dPCR在细胞及基因治疗方向的应用包括病毒载体滴度(例如:被用于定量制品中慢病毒载体滴度、AAV载体滴度、腺病毒载体滴度等),基因转导检测(例如:用于测量整合到诱导多能干(iPS)细胞、CD34 +造血干细胞、T细胞中的逆转录病毒、慢病毒载体的拷贝数)及基因治疗制品中污染物检测等。
病毒滴度测定
相对于传统的qPCR方法,dPCR在定量准确性、灵敏度及稳定性方面具有显着优势。更准确可靠的病毒载体滴度对毒理学及临床相关的给药剂量范围研究至关重要。若滴度定量虚高,则实际药效可能太低,可能无疗效;若滴度定量虚低,则可能导致严重的副作用,例如细胞因子风暴。
与qPCR相比,dPCR不需要依赖多个扩增循环来确定每个样品中相对于标准曲线的核酸含量,即dPCR允许对样品中存在的目标核酸分子进行绝对而非相对标曲的“相对”定量及相对内参的相对定量。qPCR结果的准确性、精确度与实验中使用的标准曲线直接相关,目标分子定量结果的准确性将取决于标准曲线的优化情况。在标曲样本与目标样本间扩增的差异(例如,标曲DNA的高级结构与待测目标DNA分子的高级结构可能存在明显差异)可能导致针对目标DNA定量的明显误差,因为不同结构的DNA(环形、超螺旋、线性;单链、双链;不同碱基序列引起的高级结构等)具有不同的扩增效率。因此,使用未优化的标准曲线将导致绝对定量结果不准确,这可能是不同实验室间qPCR定量结果存在显著差异的重要来源。(Susan D'Costa, et al.2016:16019)有研究表明:qPCR定量对DNA标准品中二级结构的抑制作用敏感,这可能导致高估的病毒滴度,而dPCR定量目标分子,其最终定量结果不受DNA二级结构影响,如下图所示。综上所述,相对qPCR,无需标准曲线是dPCR定量结果准确性和稳定性相对更高的原因之一。
在多数PCR基础的反应中往往会存在多种化学特性的抑制剂,这些成分存在于样品中,可能与DNA共纯化获得且难以去除。由于dPCR对影响PCR扩增效率的污染物的敏感性较低,这进一步提高了dPCR准确性和灵敏度。而qPCR技术定量原理是需测样品与标准品之间Ct值的相对定量,若需测样本或标准品中存在抑制物,则PCR效应将受影响,可能导致依赖标准曲线定量的结果不准确,若样品中的PCR抑制物抑制效应明显,则会明显降低qPCR灵敏度。
以AAV滴度检测为例,AAV滴度检测一般不对基因组进行抽提操作,且在定量其滴度前,需要用DNA酶I对其进行消化处理,以降低游离DNA对AAV定量的影响。另外,若是AAV粗品,则其中会含有大量的核酸、杂质蛋白等生物大分子,因此,无论是AAV纯品还是粗纯产品,其样本PCR反应体系中都会含有相对多的酶、衣壳蛋白或其它杂质蛋白等抑制PCR反应的成分,这些成分会干扰qPCR准确定量,可能导致qPCR定量的AAV滴度批间或批内差异大,不能很好满足基因治疗产品批内/批间稳定性要求。AAV定量急需一种定量误差小、准确且稳定性好的方法,据调研,数字PCR技术在这方面具有明显优势,且已受到越来越多业内人士的青睐。
有研究表明,dPCR技术定量下游纯化过程中的AAV样本,无论是DNA酶处理组,DNA酶和蛋白酶K处理组,其结果CV值均小于qPCR检测数据,说明dPCR检测AAV样本的稳定性高于qPCR技术。(Dobnik, David, et al.2019:1570.)
有研究报道,在qPCR和dPCR技术方法的直接比较中,针对单链AAV载体基因组的绝对定量,dPCR的灵敏度是qPCR的四倍(Lock, Martin, et al.2014:115-125)。
基因转导或基因整合情况检测
除了上述介绍的病毒滴度的定量,dPCR还具可准确检测转基因拷贝数。一项研究将dPCR与qPCR和Southern印迹技术进行了比较,以确定甘蔗中转基因的拷贝数,得出的结论是dPCR的准确性更高(Sun, Yue, and Priya Aiyar Joyce.2017: 1775-1783)。另一项研究中,研究人员将dPCR用于分析诱导多能干细胞中的转基因拷贝数,发现它优于qPCR(Lin, Huan-Ting, et al.2016: 197-208.)。与其他定量转基因拷贝数的方法相比,证明了dPCR在的准确性,因此,此方法在诊断和基因工程相关领域具有明显的优势。
制品中污染物检测
基于dPCR更好的灵敏度和稳定性,它也是检测基因药物制品中某些污染物的理想选择,例如病毒载体中细菌等微生物污染物检测、残留DNA杂质的检测、有复制能力病毒的测定的分析等。(Dobnik, David, et al.2019:1570)。例如:FDA要求需要对CAR-T产品进行复制型慢病毒(RCL)检测,以确保产品再输注给患者前,产品中不存在RCL,目前检测CAR-T产品中RCL的方法一种是基于细胞培养的方法,实验周期很长,一种是qPCR方法,灵敏度不够高,对于RCL拷贝数较低的样本,不能有效的检测出RCL。对鉴于上述方法的缺点,研发人员研发了一种采用dPCR方法检测CAR-T产品中是否存在RCL,引物针对慢病毒载体包装质粒的VSV-G包膜相应序列,研究表明dPCR在检测CAR-T产品RCL上存在明显优势,例如:提高RCL检测灵敏度;无需标曲,操作简单、减少人工误差;缩短实验周期等(T. Wiltshire,et al.2019.21)。
第三代数字PCR系统
Dobnik, David, et al. "Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors." Frontiers in microbiology 10 (2019): 1570.
Lin, Huan-Ting, et al. "Application of droplet digital PCR for estimating vector copy number states in stem cell gene therapy." Human gene therapy methods 27.5 (2016): 197-208.
Lock, Martin, et al. "Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR." Human gene therapy methods 25.2 (2014): 115-125.
Pinheiro LB, et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Anal Chem. 2012;84(2):1003–11.
Susan D'Costa, et al. "Practical utilization of recombinant AAV vector reference standards: focus on vector genomes titration by free ITR qPCR." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 3 (2016): 16019.
Sun, Yue, and Priya Aiyar Joyce. "Application of droplet digital PCR to determine copy number of endogenous genes and transgenes in sugarcane." Plant cell reports 36.11 (2017): 1775-1783.
T. Wiltshire,D. Milosevic,E. Jacob,S. Grebe,A. Dietz. Detection of lentiviral constructs for release testing of CAR- T cells using digital droplet PCR[J]. Cytotherapy,2019,21(5).
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